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熒光定量PCR

熒光定量PCR技術是通過熒光染料或熒光標記的特異性探針,對PCR產物進行標記跟蹤,實時監控反應過程。隨著PCR循環數的遞增,PCR產物不斷積累,熒光信號也會相應的增加,這樣就可以通過熒光強度的變化來對PCR反應進行實時的監測,并以b-Actin或GAPDH等管架基因作為內參照,對目的基因的表達量進行半定量檢測。

熒光定量PCR技術具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點,目前已得到廣泛應用。實時熒光定量PCR技術是一次由定性技術向定量技術的飛躍,運用該項技術,可以對DNA、RNA樣品進行相對定量、絕對定量和定性分析。

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菲優特檢測生物將根據您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探針法。通過對DNA或RNA的熒光定量PCR監測, 實現基因的相對定量、絕對定量和定性分析。

SYBR Green熒光染料法:適用于任何DNA,無需設計探針,采取雙標準曲線法,實驗周期短,結果重復性好,靈敏度高。

TaqMan熒光探針法:經驗豐富的實驗技術人員設計探針,對目標基因有高特異性,實驗重復性好,相對于SYBR Green法,靈敏度更高。

 熒光定量PCR檢測分類 

1、mRNA表達量水平檢測:相對定量法。

2、MicroRNA表達量水平檢測:通過設計特殊莖環結構的反轉錄引物,結合實時定量PCR可以精確檢測微量樣品中microRNA表達水平。內參基因一般用U6。

3、基因拷貝數檢測:如檢測樣品中不同細菌含量、基因工程菌目的基因拷貝數、環境中耐藥基因檢測等。采用絕對定量法。

熒光定量PCR服類容 

1、絕對定量:

絕對定量首先必須構建與檢測樣品目的基因具有相同序列的標準品。使用已知濃度的標準品制作3個點以上的標準曲線后,可以使用標準曲線對未知濃度的檢測樣品進行絕對量(起始拷貝數)分析。

2、相對定量(mRNA表達量分析):

基因表達的研究一般采用相對定量的方法。相對定量法必須對樣品的目的基因和參比基因內標同時分別進行定量,然后求出對于參比基因的目的基因的相對量。通過對樣品間的目的基因的相對量進行比較,可以對不同樣品間的mRNA進行表達量分析。參比基因通常選用表達量相對恒定的House Keeping Gene,如:GAPDH、b-actin等。通過同時對參比基因的實時檢測,可以對樣品之間由于起始細胞數不同、或RNA提取效率的不同等造成的RNA量誤差進行校正,達到在嚴格意義上對樣品之間的mRNA表達量進行分析之目的。

 熒光定量PCR服務流程 

總RNA提取及定量 → PCR引物設計及反轉錄 → 熒光引物設計(SYBR Green 熒光染料法)/探針設計(TaqMan 熒光探針法) → 熒光定量PCR,進行擴增曲線、溶解曲線、表達量差異分析等實驗 → 數據分析與處理

熒光定量PCR送檢要求

新鮮或保存完好的樣品——細胞:≥1×106,組織≥20 ?mg,血液≥200μl。組織樣品用液氮速凍后保存于-80℃,細胞也可以在加入Trizol后保存于-80℃,后續樣品需用干冰寄送。樣品需要注意避免各類污染和反復凍融。

菲優特檢測秉承“科學 · 獨立 · 誠信 · 高效”的服務理念,以專業、專注的態度為您提供精確的檢測技術和咨詢、科研服務。

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